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多肿瘤抑制基因p16与肿瘤发生发展的关系

多肿瘤抑制基因p16与肿瘤发生发展的关系

更新时间:2011-08-01 22:35:27    字体:   |  | 
【关键词】  多肿瘤
  癌症是人类面临的最大难题,随着分子生物学和基因工程的进展,使我们认识到肿瘤发生的关键是正常细胞内基因组发生了改变,基因改变是导致肿瘤的根本原因[]。近期的研究结果显示从肿瘤的诱发到进展是一个多阶段、多因素的复杂过程,这个复杂过程包括肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因的失活,肿瘤基因和肿瘤抑制基因分别以正性和负性调节细胞的生长,并参与肿瘤的形成[]。到目前为止,人类已发现多个癌基因和多种抑癌基因。年代中期抑癌基因被发现以来,其重要作用得到广泛认可,抑癌基因(tumor supress gene)是正常细胞在调控细胞增殖、分化等方面起重要作用的基因,它在保持基因组结构稳定、促进细胞生长、诱导细胞凋亡等方面均有重要意义,它的缺失或失活可引起细胞内癌基因(oncogene)的活化,造成细胞的过度增生、分化,导致恶性肿瘤的发生和发展。癌基因和抑癌基因共同参与调节细胞周期活动的分子过程已为现今癌症研究的重要课题之一。研究肿瘤发病的分子生物学机制,了解各种肿瘤细胞增殖周期中调控因子的状况,对于进行基因诊断、基因治疗无疑具有重大意义。
    p(MTS)基因的发现和基本结构
  年美国Skolnick等在黑色素瘤患者中发现有与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)相结合的蛋白,但这种蛋白的基因未被克隆出,随后对个黑色素瘤细胞系采用染色体步移法和序列标记位点图进行分析,发现/的肿瘤细胞在染色体p区发生频繁的基因突变,推测该区域含有黑色素瘤的易感基因[],此后在许多人类肿瘤集及体外细胞系中均发现p区的缺失和突变。年,美国长岛冷泉实验室研究的细胞先驱Serano等利用酵母双杂和蛋白相关性筛选法(yeast two-hybrid protein interaction screen)发现并分离了特异性的细胞周期素依赖性激酶(CDK)抑制蛋白(CDKI)-p蛋白,证明p与CDK结合后cyclinD/CDK复合物的催化作用明显降低,并克隆了p的cDNA。年美国盐湖城Kamb等[]和圣地亚哥的Nobori[]分别报道发现一个新的抑癌基因:p,两个研究小组发表了一项重要的研究成果发现一个新的抑癌基因:p蛋白,证明p与CDK结合后cyclinD/CDK复合物的催化作用明显降低,并克隆了P的cDNA。Kamb[]在对黑色素瘤染色体p易感区应用物理图(physical map)和序列标记位点图(sequence tagged stites,STSs)分析了个黑色素瘤细胞系的纯合缺失,发现在两个区域与Serrano报道的p序列相近,命名为多发性肿瘤抑制因子(multiple tumor suppress ,MTS)和MTS,其中MTS和p完全吻合,而MTS与p序列有%相同,现命名为p(kamb A.S
cience,,,-)。p基因位于人类的号染色体短臂(p)上,由个外显子和个内含子组成,外显子包括Eα和Eβ,Eα,bp;Eβ,bp;外显子 bp;外显子 bp。全长.kb,氨基酸序列分析表明成熟的p分子量为.kD的单链多肽,含有一个由个氨基酸组成的开放阅读框架,具有一个有个ankyrin序列组成(回钩状重叠的空间构型的蛋白结构),这一构型为维持其活性所必需,参与蛋白与蛋白之间的作用[]。
    作用机制
  细胞增殖分裂是细胞最基本的生理活动,越来越多的研究证明,细胞分裂周期的精确性及定时性是正常细胞生长和分化所必需的,细胞作为机体的最小单位,其生长过程总是处于一种增殖的动态平衡之中,这才能保证机体正常的生长、发育。这就意味着细胞内必然存在着促进和抑制增殖两种体系[],包含于这一过程中的蛋白质及基因的改变与肿瘤发生及其恶性表形密切相关。典型的一个细胞周期包括有严格顺序的个期即GSGM,它是由MPF(maturation promoting factor,MPF)所推动。并受到信号转导途径和反馈环路的精密调控。MPF含两种蛋白质组分,其一为cdc蛋白(cell division cycle protein),另一为细胞周期蛋白(cyclin),在整个细胞周期中cdc蛋白的浓度是稳定的,它的活动受到细胞周期蛋白的调节,细胞是否进入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取决于其能否顺利通过若干关卡(check points),其中最重要的是G/S转换和G/M转换。前者又称为“启动点(start)”或“限制点(restriction point)”,位于G期末,DNA合成的起始,后者位于M期的初始。现已证明,激活的CDK在这两个转换过程中起关键作用[]。在高等的真核细胞,细胞周期蛋白分为A、B、C、D、E五种,它们分别在细胞周期的不同时期积累,激活相关细胞周期蛋白激酶(CDK),使之具有蛋白激酶活性。G期细胞周期蛋白是指在G或G/S交界处发挥作用启动细胞周期并促进DNA合成的周期蛋白,有C、D、E等多种,其中cyclinD能激活CDK、调节G/S转换,促进细胞分裂周期由G期进入到S期,进行DNA合成[],cyclinD实际上可以视为一种癌基因,其过度表达会导致细胞增殖失控。最重要的研究发现是CDK抑制因子与肿瘤生长密切相关,对于CDK抑制因子p的研究首先证明了这一点,p是作为含有PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在内的CyclinD-CDK四聚体复合物中的一员在正常人纤维母细胞中首先被发现的[]。对p的研究进一步阐明了CDK抑制因子在肿瘤发生发展中的作用。这就构成了cyclins(细胞周期素)-CDKs(细胞周期素依赖性蛋白激酶,cyclins dependent kinases)-CKIs(细胞周期素依赖性蛋白激酶的抑制蛋白,cyclins dependent kinases inhibitors)这一以CDKs为中心的细胞周期网络调控系统。p通过与cyclinD竞争结合CDK、CDK抑制cyclinD/CDK的活性,参与并调节细胞从G期进入G期,去除p的抑制作用,将使细胞异常增殖,过度周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活,都会导致CDKs的过度作用,导致细胞非正常增生。野生型抑癌基因Rb的蛋白产物PRb的活性是通过磷酸化作用获得的,CDK、CDK作为PRb的激酶与此密切相关,Liu等[]提出PRb发生磷酸化后,导致与PRb结合的TF(Transcription Factor)的释放,如EF,EF是通过激活与细胞增殖有关的基因,如DNA合成酶-α,从而调控细胞周期由G期到S期,EF与未磷酸化的PRb结合时没有转录活性,但与磷酸化的PRb分离后将激活p基因转录,随着p mRNA水平的增多,和CDK、CDK结合的p也增多,致使cyclinD/CDK、

    

CDK的激酶活性受到抑制,低磷酸化的PRb为其活性状态,PRb磷酸化水平下降,p基因的录也随之降低[]。Joseph Geradts等[]在实验中证实,在人类许多肿中,Rb过表达的细胞系都伴有p表达下降,反之亦然。在p过表达的细胞系无一例外地有Rb蛋白和/或p蛋白失活,而Rb蛋白的失活对p更有直接作用,Rb蛋白可抑制p蛋白表达,进一步影响cyclinD表达[]。Beach等[]认为正常细胞中存在着一个由Rb、p、cyclinD/CDK、CDK共同组成的反馈调节圈。p在正常细胞调控周期中起负反馈作用,p基因影响Rb基因在细胞增殖中的调节作用,结合细胞周期的研究,在G/S转化过程中,PRb由于磷酸化失活,失活的PRb一方面促进细胞进入S期,另外PRb通过转录因子,如EF促进p的转录,反而又抑制cyclinD-CDK中间的反馈作用,而达到对细胞从G期到S期的转变过程的调控。除此之外,p对p的表达也起负向调节作用。目前发现的细胞周期抑制蛋白根据其结构和功能分为两类:一类包括p、p、p、p;另一类包括p、p。它们对细胞增殖起负调控作用[]。p外显子包括Eα和Eβ两种,pβ是p的另一个选择替换转录模本,它由位于p-exon上游约kb最新发现的短片段(exonβ)拼接至p外显子、上而成,那么就有可能产生两种转录产物:pα mRNA和pβ mRNA[]。Duro等[]研究发现在B淋巴细胞位于p染色体p外显子上游的一个片段(.kb)的嵌合转录模本,它可作为p选择拼接转录模本的一部分而被转录,它与编码p蛋白的开放阅读框架(ORF)不一致,这种情况可能产生两种蛋白,p蛋白及另一截断的p蛋白(pβ蛋白),分子量为.kD,pβ转录模本将能起始翻译产生一种不同于p的蛋白,尽管pβ角色有待阐明,日前的研究证实大鼠的pβ在肿瘤抑制作用中扮演重要角色。实验发现体外转染pβ cDNA可抑制人或小鼠肿瘤的生长[]。pβ转录模本在鼻咽部过度增生的上皮细胞及发生突变和过甲基化的鼻咽癌组织细胞中表达。Quelle[]等转染pβ cDNA到T成纤维细胞中而观察到细胞周期停滞在G~G或G~M期。Liggett[]同样通过细胞转染证实pβ和p一样具有生长抑制作用,并这种抑制作用不需要功能性的PRb的存在。鼠的pβ(pARF)比推断的人类pβ蛋白长个氨基酸,但目前还没有人类细胞内源性pβ mRNA翻译产生蛋白的证据。
    p基因及其产物在肿瘤中的失活机制
  p基因及其产物在人类许多原发性肿瘤和细胞株中发生改变,如脑肿瘤、头颈癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等[]均发现较高的p基因的失活,主要失活机制有:突变、纯合性缺失及′CPG岛甲基化失活等。()p基因的突变包括无义突变、错义突变和移码突变。其突变部位主要在外显子和外显子。虽然大部分肿瘤细胞系中检测到p基因突变,但原发性肿瘤组织中除胰腺癌和食管癌及成胶质细胞瘤外,其他肿瘤p基因突变率很低,SUN等[]利用SSCP直接测序的方法在例鼻咽癌和个鼻咽癌细胞系均未发现p基因的点突变,LO[]等也发现在原发性鼻咽癌及鼻咽癌的异种移植物中均未发现p基因突变。Zhang等只检测到/的原发性头颈鳞癌和/的头颈鳞癌细胞系中p基因的点突变,所以点突变并不是p基因失活的主要方式,且突变只有发生在编码p蛋白个钩状重复结构区域内的DNA序列,才导致p
蛋白失去对cyclinD/CDK的抑制作用,而蛋白羧基末端区对结合与抑制CDK活性并不重要。()Melo等[]通过对一些细胞系和原发性肿瘤p基因的研究发现p基因的纯合性缺失是p基因在肿瘤中失活的主要机制,%的恶性间皮瘤、%的星形细胞瘤、%~%的脑胶质瘤[,]、%~%的骨肉瘤、%~%的乳腺癌、胰腺癌和肾癌,%~%的恶性黑素瘤[]、头颈部肿瘤[]和白血病%~%的膀胱癌[]、肺癌[,]、卵巢癌和淋巴瘤的细胞系中发生纯合性缺失。而在睾丸肿瘤、宫颈癌和结肠癌、神经母细胞癌[]细胞系中未发现p基因的纯合性缺失。且发现原发性肿瘤组织中p基因的缺失率低于相应肿瘤细胞系[]在乳腺癌[]殖系肿瘤组织[]未检测出p基因的改变。()DNA甲基化对于正常胚胎的发育是必需的,但它的异常却能导致肿瘤的发生。近年来发现肿瘤细胞中出现染色体区域性高甲基化与抑癌基因功能的丢失有关,可能是肿瘤甲基化不平衡中的重要部分,基因启动子区域′CPG岛甲基化常伴有基因的转录失活。CPG岛是基因组C、G富集区,细胞中约有%的基因启动子区域具有CPG岛[]。正常情况下,除失活的X染色体[]外,常染色体基因CPG岛均处于非甲基化状态,而在细胞癌变过程中(包括头颈部肿瘤)常染色体基因CPG岛存在广泛的甲基化p基因的外显子启动子区域存在一CPG岛,在被检测的正常组织中它处于非甲基状态。在一些p等位基因较少发生点突变或纯合性缺失的人类肿瘤中,如小细胞肺癌株出现高比例(%)的′CPG岛甲基化而失去转录活性[];在乳腺癌(%)、前列腺癌(%)、肾癌(%)细胞株中及原发性的乳腺癌(%)和结肠癌(%)也出现同样现象,特别是结肠癌细胞系中甲基化发生率高达%,尤其是在一些未发生纯合性缺失的结肠癌细胞中,p基因的两个等位基因都出现异常甲基化,并与其完全失活是相关的[]。后来又发现在结肠癌病人的正常结肠黏膜也出现甲基化,这在正常细胞常染色体基因中是罕见的,一般岛都是非甲基化的。p基因的甲基化失活也发生在其他原发性人类肿瘤:包括膀胱癌、肺癌、头颈部鳞癌[,]。由此可见,p基因通常是通过纯合性缺失和′CPG岛甲基化而失去抑制生长的功能。Merlo等[]还发现,p甲基化具有一定的基因特异性,在一些肿瘤细胞株中,位于染色体p与p相邻的p/MTS基因CPG岛未见甲基化。p甲基化发生于不同肿瘤的不同时期,p甲基化发生于头颈部鳞癌等恶性肿瘤的早期,可能具有早期肿瘤的诊断价值,而在食管癌的中晚期,与食管鳞状细胞癌的转移及浸润有关[]。所以在进行肿瘤分子筛选时只需测定其产物(如荧光免疫原位杂交、免疫组化),较之测定基因结构改变更为优越。另一方面,不象突变和缺失等基因改变,甲基化基因改变是可逆的,如去甲基化剂aZadC处理可诱导头颈部癌和肺癌细胞株中p的再表达[],并可抑制肿瘤细胞的生长。因此,抑制基因甲基化的研究,对人类肿瘤的防止具有重要的意义。
p甲基的失活机制与其他抑癌基因不同,不是通过丢失一个等位基因,继之另一等位基因出现突变而失活,而主要表现为p基因的纯合性缺失和′CPG岛的甲基化。
  4  小结
  p16作为一种抑癌基因,它有比以往所发现的任一种抑癌基因与人类多种肿瘤的发生、发展的关系更为密切、广泛。其致癌机制更清晰、直接,它的作用对象单一,并且该基因小易于操作,p16可与其他抑癌基因如Rb、p53相互协调,共同抗癌。因此,以p16基因作为目的基因的基因替代治疗,以及针对p16基因甲基化失活的治疗,将在包括喉癌在内的人类肿瘤的基因治疗中具有广阔的应用前景。
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